第一篇 高效液相色譜法 2 原理 樣品中的維生素A及維生素E經皂化提取處理后將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中用高效液相色譜法C18反相柱將維生素A和維生素E分離經紫外檢測器檢測并用內標法定量測定最小檢出量分別為VA0.8ngα－E91.8ngγ－E36.6ngδ－E20.6ng 3 試劑 實驗用水為蒸餾水試劑不加說明為分析純 3.1 無水乙醚不含有過氧化物 3.1.1 過氧化物檢查方法用5mL乙醚加1mL 10%碘化鉀溶液振搖1min如有過氧化物則放出游離碘水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液水層呈藍色該乙醚需處理后使用 3.1.2 去除過氧化物的方法重蒸乙醚時瓶中放入純鐵絲或鐵末少許棄去10%初餾液和10%殘餾液 3.2 無水乙醇不得含有醛類物質 3.2.1 檢查方法取2mL銀氨溶液于試管中加入少量乙醇搖勻再加入10%氫氧化鈉溶液加熱放置冷卻后若有銀鏡反應則表示乙醇中有醛 3.2.2 脫醛方法取2g硝酸銀溶于少量水中取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中將兩者傾入1L乙醇中振搖后放置暗處兩天不時搖動促進反應經過濾置蒸餾瓶中蒸餾棄去初蒸出的50mL當乙醇中含醛較多時硝酸銀用量適當增加 3.3 無水硫酸鈉 3.4 甲醇重蒸后使用 3.5 重蒸水水中加少量高錳酸鉀臨用前蒸餾 3.6 10%抗壞血酸溶液m/V臨用前配制 3.7 1∶1氫氧化鉀溶液 3.8 10%氫氧化鈉溶液m/V 3.9 5%硝酸銀溶液m/V 3.10 銀氨溶液加氨水至5%硝酸銀溶液中直至生成的沉淀重新溶解為止再加10%氫氧化鈉溶液數滴如發生沉淀再加氨水直至溶解 3.11 維生素A標準液視黃醇純度85%或視黃醇乙酸酯純度90%經皂化處理后使用用脫醛乙醇溶解維生素A標準品使其濃度大約為1mL相當于1mg視黃醇臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度 3.12 維生素E標準液α－生育酚純度95%γ－生育酚純度95%δ－生育酚純度95%用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標準品使其濃度大約為1mL相當于1mg臨用前用紫外分光光度法分別標定此三種維生素E的準確濃度 3.13 內標溶液稱取苯并〔e〕芘純度98%用脫醛乙醇配制成每1mL相當于10μg苯并〔e〕芘的內標溶液 3.14 pH1～14試紙 4 儀器和設備 4.1 實驗室常用設備 4.2 高壓液相色譜儀帶紫外分光檢測器 4.3 旋轉蒸發器 4.4 高速離心機 4.4.1 小離心管具塑料蓋1.5～3.0mL塑料離心管與高速離心機配套 4.5 高純氮氣 4.6 恒溫水浴鍋 4.7 紫外分光光度計 5 操作步驟 5.1 樣品處理 5.1.1 皂化 稱取1～10g樣品含維生素A約3μg維生素E各異構體約為40μg于皂化瓶中加30mL無水乙醇進行攪拌直到顆粒物分散均勻為止加5mL 10%抗壞血酸苯并〔e〕芘標準液2.00mL混勻加10mL11氫氧化鉀混勻于沸水浴上回流30min使皂化完全皂化后立即放入冰水中冷卻 5.1.2 提取 5.1.2.1 將皂化后的樣品移入分液漏斗中用50mL水分2～3次洗皂化瓶洗液并入分液漏斗中用約100mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣乙醚液并入分液漏斗中如有殘渣可將此液通過有少許脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗輕輕振搖分液漏斗2min靜置分層棄去水層 5.1.3 洗滌 5.1.3.1 用約50mL水洗分液漏斗中的乙醚層用pH試紙檢驗直至水層不顯堿性最初水洗輕搖逐次振搖強度可增加 5.1.4 濃縮 5.1.4.1 將乙醚提取液經過無水硫酸鈉約5g濾入與旋轉蒸發器配套的250～300mL球形蒸發瓶內用約10mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次并入蒸發瓶內并將其接至旋轉蒸發器上于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚待瓶中剩下約2mL乙醚時取下蒸發瓶立即用氮氣吹掉乙醚立即加入2.00mL乙醇充分混合溶解提取物 5.1.5 將乙醇液移入一小塑料離心管中4.4.1離心5min5000rpm上清液供色譜分析如果樣品中維生素含量過少可用氮氣將乙醇液吹干后再用乙醇重新定容并記下體積比 5.2 標準曲線的制備 5.2.1 維生素A和維生素E標準濃度的標定方法 取維生素A和各維生素E標準液若干微升分別稀釋至3.00mL乙醇中并分別按給定波長測定各維生素的吸光值用比吸光系數計算出該維生素的濃度測定條件如下表所示 表1 標 準 加入標準的量 sμl 比吸光系數 波 長 λnm 視 黃 醇 γ－生育酚 δ－生育酚 α－生育酚 10.00 100.0 100.0 100.0 1835 71 92.8 91.2 325 294 298 298 濃度計算 5.2.2 標準曲線的制備 本方法采用內標法定量把一定量的維生素Aγ－生育酚α－生育酚δ－生育酚及內標苯并〔e〕芘液混合均勻選擇合適靈敏度使上述物質的各峰高約為滿量程70%為高濃度點高濃度的1/2為低濃度點其內標苯并〔e〕芘的濃度值不變用此二種濃度的混合標準進行色譜分析結果見色譜圖維生素標準曲線繪制是以維生素峰面積與內標物峰面積之比為縱坐標維生素濃度為橫坐標繪制或計算直線回歸方程如有微處理機裝置則按儀器說明用二點內標法進行定量 本方法不能將β－E和γ－E分開故γ－E峰中包含有β－E峰 5.3 高效液相色譜分析 5.3.1 色譜條件推薦條件 5.3.1.1 預柱ultrasphere ODS 10μm4mm×4.5cm 5.3.1.2 分析柱ultrasphere ODS 5μm4.6mm×25cm 5.3.1.3 流動相甲醇∶水＝98∶2混勻于臨用前脫氣 5.3.1.4 紫外檢測器波長300nm量程0.02 5.3.1.5 進樣量20μL 5.3.1.6 流速1.7mL/min 5.4 樣品分析 取樣品濃縮液20μL待繪制出色譜圖及色譜參數后再進行定性和定量 5.4.1 定性用標準物色譜峰的保留時間定性 5.4.2 定量根據色譜圖求出某種維生素峰面積與內標物峰面積的比值以此值在標準曲線上查到其含量或用回歸方程求出其含量 6 計算 式中X2某種維生素的含量mg/100g C由標準曲線上查到某種維生素含量μg/mL V樣品濃縮定容體積mL m樣品質量 g 用微處理機二點內標法進行計算時按其計算公式計算或由微機直接給出結果 7 結果的允許差 同一實驗室同時測定或重復測定結果相對偏差絕對值≤10% 第二篇 比色法 8 原理 維生素A在三氯甲烷中與三氯化銻相互作用產生藍色物質其深淺與溶液中所含維生素A的含量成正比該藍色物質雖不穩定但在一定時間內可用分光光度計于620nm波長處測定其吸光度 9 試劑 本實驗用水均為蒸餾水 9.1 無水硫酸鈉同3.3 9.2 乙酸酐 9.3 乙醚同3.1 9.4 無水乙醇同3.2 9.5 三氯甲烷應不含分解物否則會破壞維生素A 9.5.1 檢查方法 三氯甲烷不穩定放置后易受空氣中氧的作用生成氯化氫和光氣檢查時可取少量三氯甲烷置試管中加水少許搖振使氯化氫溶到水層加入幾滴硝酸銀液如有白色沉淀即說明三氯甲烷中有分解產物 9.5.2 處理方法 試劑應先測驗是否含有分解產物如有則應于分液漏斗中加水洗數次加無水硫酸鈉或氯化鈣使之脫水然后蒸餾 9.6 25%三氯化銻－三氯甲烷溶液用三氯甲烷配制25%三氯化銻溶液儲于棕色瓶中注意勿使吸收水分 9.7 1∶1氫氧化鉀溶液 9.8 維生素A或視黃醇乙酸酯標準液同3.11其標定方法同5.2.1 9.9 酚酞指示劑用95%乙醇配制1%溶液 10 儀器和設備 10.1 實驗室常用設備 10.2 分光光度計 10.3 回流冷凝裝置 11 操作步驟 維生素A極易被光破壞實驗操作應在微弱光線下進行或用棕色玻璃儀器 11.1 樣品處理根據樣品性質可采用皂化法或研磨法 11.1.1 皂化法適用于維生素A含量不高的樣品可減少脂溶性物質的干擾但全部試驗過程費時且易導致維生素A損失 11.1.1.1 皂化根據樣品中維生素A含量的不同稱取0.5～5g樣品于三角瓶中加入10mL 1∶1氫氧化鉀及20～40mL乙醇于電熱板上回流30min至皂化完全為止 11.1.1.2 提取將皂化瓶內混合物移至分液漏斗中以30mL水洗皂化瓶洗液并入分液漏斗如有渣子可用脫脂棉漏斗濾入分液漏斗內用50mL乙醚分二次洗皂化瓶洗液并入分液漏斗中振搖并注意放氣靜置分層后水層放入第二個分液漏斗內皂化瓶再用約30mL乙醚分二次沖洗洗液傾入第二個分液漏斗中振搖后靜置分層水層放入三角瓶中醚層與第一個分液漏斗合并重復至水液中無維生素A為止 11.1.1.3 洗滌用約30mL水加入第一個分液漏斗中輕輕振搖靜置片刻后放去水層加15～20mL 0.5mol/L氫氧化鉀液于分液漏斗中輕輕振搖后棄去下層堿液除去醚溶性酸皂繼續用水洗滌每次用水約30mL直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止大約3次醚層液靜置10～20min小心放出析出的水 11.1.1.4 濃縮將醚層液經過無水硫酸鈉濾入三角瓶中再用約25mL乙醚沖洗分液漏斗和硫酸鈉兩次洗液并入三角瓶內置水浴上蒸餾收回乙醚待瓶中剩約5mL乙醚時取下用減壓抽氣法至于立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中維生素A含量在適宜濃度范圍內 11.1.2 研磨法適用于每克樣品維生素A含量大于5～10μg樣品的測定如肝的分析步驟簡單省時結果準確 11.1.2.1 研磨精確稱2～5g樣品放入盛有3～5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中研磨至樣品中水分完全被吸收并均質化 11.1.2.2 提取小心她將全部均質化樣品移入帶蓋的三角瓶內準確加入50～100mL乙醚緊壓蓋子用力振搖2min使樣品中維生素A溶于乙醚中使其自行澄清大約需1～2h或離心澄清因乙醚易揮發氣溫高時應在冷水浴中操作裝乙醚的試劑瓶也應事先放入冷水浴中 11.1.2.3 濃縮取澄清提取乙醚液2～5mL放入比色管中在70～80℃水浴上抽氣蒸干立即加入1mL三氯甲烷溶解殘渣 12 測定步驟 12.1 標準曲線的制備 準確取一定量的維生素A標準液于4～5個容量瓶中以三氯甲烷配制標準系列再取相同數量比色管順次取1mL三氯甲烷和標準系列使用液1mL各管加入乙酸酐1滴制成標準比色列于620nm波長處以三氯甲烷調節吸光度至零點將其標準比色列按順序移入光路前迅速加入9mL三氯化銻－三氯甲烷溶液于6s內測定吸光度將吸光度為縱坐標以維生素A含量為橫坐標繪制標準曲線圖 12.2 樣品測定 于一比色管中加入10mL三氯甲烷加入1滴乙酸酐為空白液另一比色管中加入1mL三氯甲烷其余比色管中分別加入1mL樣品溶液及1滴乙酸酐其余步驟同標準曲線的制備 13 計算 式中X樣品中含維生素A的量mg/100g如按國際單位每1國際單位＝0.3μg維生素A c由標準曲線上查得樣品中含維生素A的含量μg/mL m樣品質量g V提取后加三氯甲烷定量之體積mL 100以每百克樣品計
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