細(xì)胞凋亡的特征及其檢測(cè)方法研究
摘要細(xì)胞凋亡是動(dòng)物機(jī)體組織清除受損衰老或多余細(xì)胞的一種自殺性過(guò)程它對(duì)于保持機(jī)體各組織器官正常生長(zhǎng)發(fā)育結(jié)構(gòu)功能動(dòng)態(tài)平衡和維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定等都具有重要意義發(fā)生凋亡的細(xì)胞大多數(shù)是生物個(gè)體中多余或老化的細(xì)胞有些也是發(fā)生腫瘤時(shí)的細(xì)胞或受到病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞根據(jù)不同的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)不同類(lèi)型的細(xì)胞凋亡進(jìn)而來(lái)研究細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象和發(fā)生機(jī)制為揭示機(jī)體與細(xì)胞凋亡的關(guān)系和疾病與凋亡的關(guān)系提供理論依據(jù)文章對(duì)凋亡細(xì)胞的特征細(xì)胞凋亡各種檢測(cè)方法的檢測(cè)原理和結(jié)構(gòu)判定分別進(jìn)行了概述
關(guān)鍵詞細(xì)胞凋亡原理檢測(cè)
細(xì)胞凋亡apoptosis或稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡programmedcelldeathPCD是指細(xì)胞本身在一定的生理或病理?xiàng)l件下按照自身的程序主動(dòng)性生理性的死亡過(guò)程它是一個(gè)多步驟由基因調(diào)控的發(fā)生過(guò)程涉及到一系列基因的激活表達(dá)以及調(diào)控作用這是個(gè)井然有序的過(guò)程并不是病理?xiàng)l件下的損傷現(xiàn)象而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程早在100多年前人們已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡這種死亡形式但是沒(méi)有給其下定義在20世紀(jì)70年代病理學(xué)家KerrJFR等[1]發(fā)現(xiàn)在大鼠肝細(xì)胞局部缺血條件下肝細(xì)胞連續(xù)不斷地轉(zhuǎn)化為小的圓形的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)后來(lái)經(jīng)過(guò)深思熟慮在1972年提出并命名為細(xì)胞凋亡隨后的幾十年里對(duì)細(xì)胞凋亡的研究受到許多國(guó)家科學(xué)家的廣泛重視進(jìn)入20世紀(jì)90年代對(duì)細(xì)胞凋亡的研究更是飛速發(fā)展獲得了重大突破受到了生物學(xué)醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的普遍關(guān)注和重視目前人們對(duì)凋亡的發(fā)生機(jī)制及與疾病的關(guān)系已經(jīng)有了比較全面清晰的認(rèn)識(shí)這對(duì)重新認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有劃時(shí)代的意義隨著對(duì)凋亡認(rèn)識(shí)的不斷深入出現(xiàn)了一系列檢測(cè)細(xì)胞凋亡的新技術(shù)和新方法
1凋亡細(xì)胞的特征
1.1形態(tài)學(xué)的改變
根據(jù)形態(tài)學(xué)變化經(jīng)過(guò)可將細(xì)胞凋亡分為3個(gè)過(guò)程①凋亡開(kāi)始時(shí)細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛細(xì)胞突起及細(xì)胞表面的褶皺消失但細(xì)胞膜依然完整沒(méi)有失去選擇通透性線(xiàn)粒體大體保持完整但是偶爾也見(jiàn)到線(xiàn)粒體變大嵴增多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹擴(kuò)大細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)有時(shí)變得致密和紊亂染色質(zhì)濃縮分布在核膜周?chē)蛞粋?cè)呈眼球狀②形成凋亡小體apoptoticbody產(chǎn)生凋亡小體有兩種方式一種為發(fā)芽脫落機(jī)制首先染色體斷裂為大小不等的片斷然后通過(guò)發(fā)芽起泡與一些細(xì)胞器聚集在一起形成一球形的突起形成凋亡小體另一種為自噬體形成機(jī)制凋亡細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等和一些細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)成分一起被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹再與細(xì)胞膜融合后形成凋亡小體[2]③凋亡小體形成后被巨噬細(xì)胞或者鄰近的細(xì)胞吞噬消化此過(guò)程不影響其他細(xì)胞的生理功能也不引起周?chē)?xì)胞的炎癥反應(yīng)[3]
從細(xì)胞發(fā)生凋亡開(kāi)始到出現(xiàn)凋亡小體僅需數(shù)分鐘而被吞噬消化整個(gè)過(guò)程可持續(xù)4h～9h[4]
1.2生化特征
凋亡發(fā)生時(shí)線(xiàn)粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p使細(xì)胞生成ATP的量減少跨膜電位降低細(xì)胞色素C從線(xiàn)粒體內(nèi)漏到胞質(zhì)中線(xiàn)粒體膜的通透性升高[5]胞漿中Ca2＋和Mg2＋濃度升高可以激活核酸內(nèi)切酶和蛋白酶[6]激活的核酸內(nèi)切酶可以將DNA切成50bp～300bp大小的DNA然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小體形成180bp～200bp的DNA片斷而蛋白酶可以控制不同階段的凋亡的發(fā)生與此同時(shí)胞漿中pH也發(fā)生了改變
2凋亡細(xì)胞的檢測(cè)
隨著研究技術(shù)的提高和對(duì)細(xì)胞凋亡認(rèn)識(shí)的不斷深入檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法已經(jīng)從細(xì)胞染色質(zhì)水平發(fā)展到分子水平檢測(cè)技術(shù)也日趨成熟一般可將檢測(cè)方法分為細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)生物化學(xué)變化DNA片斷流式細(xì)胞儀FCM分析細(xì)胞凋亡酶學(xué)分析等等
2.1細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)
在凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)的各種方法中其檢測(cè)手段均不能很好地對(duì)凋亡細(xì)胞做定量分析但定性分析有時(shí)由于環(huán)境因子或其他因素的影響并非所有凋亡細(xì)胞都具有典型的凋亡形態(tài)特征[7]可是形態(tài)學(xué)觀察簡(jiǎn)便直觀并可保存標(biāo)本
2.1.1光學(xué)顯微鏡下觀察①原理普通光鏡觀察可以用石蠟切片HE染色法甲基綠派諾寧染色法姬姆薩染色和瑞氏染色等HE染色是根據(jù)正負(fù)電荷之間的同性排斥異性相吸原理來(lái)進(jìn)行染色的但是如果要辨別是壞死細(xì)胞還是凋亡細(xì)胞必須要在染色后進(jìn)行分化和藍(lán)化處理甲基綠派諾寧染色法是根據(jù)發(fā)生凋亡時(shí)mRNA的表達(dá)增強(qiáng)DNA對(duì)甲基綠染色具有特異性RNA對(duì)派諾寧具有親和性姬姆薩染色和瑞氏染色也是根據(jù)染料對(duì)DNA或者RNA具有特異性建立起來(lái)的染色方法②結(jié)果判定HE染色可見(jiàn)凋亡的細(xì)胞變圓變小核濃染或者裂解成為大小不等的碎片和染色質(zhì)染成藍(lán)色或者藍(lán)黑色壞死組織呈均質(zhì)紅染的無(wú)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)核染色消失甲基綠派諾寧染色在光鏡下見(jiàn)到凋亡細(xì)胞的固縮細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色或者藍(lán)綠色著染而壞死細(xì)胞為綠色著染但是光鏡檢查難以觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化
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2.1.2熒光顯微鏡觀察①原理有些熒光染料對(duì)細(xì)胞DNA具有特異親和性但是熒光染料對(duì)活細(xì)胞凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞均顯示不同的顏色所以可以用熒光染料顯示凋亡時(shí)細(xì)胞核的形態(tài)特征且此種方法比較簡(jiǎn)單操作性也比較強(qiáng)是臨床和基層檢查首選的方法之一常用的熒光染料有吖啶橙碘化丙啶和溴化乙錠但是檢測(cè)凋亡一般用吖啶橙溴化乙錠混合染色法②結(jié)果判定熒光顯微鏡下可見(jiàn)到活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光胞質(zhì)呈橘黃色或者橘紅色熒光出現(xiàn)凋亡細(xì)胞時(shí)核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)凋亡細(xì)胞核的特征性形態(tài)可被清晰地辨認(rèn)[8]壞死細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或者橘黃色熒光減弱有的甚至消失
2.1.3透射電鏡觀察①原理透射電鏡[9]檢查細(xì)胞凋亡認(rèn)為是最經(jīng)典可靠的判定細(xì)胞凋亡的方法被認(rèn)為是鑒定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)但是此方法對(duì)細(xì)胞凋亡只能進(jìn)行定性檢測(cè)而不能定量檢測(cè)這是其惟一的不足其觀察細(xì)胞凋亡的標(biāo)本制作采用常規(guī)方法取材固定包埋和制片與一般制片區(qū)別不大但在取材和固定時(shí)要加以注意②結(jié)果判定在電鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)相應(yīng)的變化表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮膜消失內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張又可見(jiàn)到細(xì)胞表面的偽足形成和微絨毛消失細(xì)胞膜呈波浪狀起伏
2.2DNA分子水平檢測(cè)
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)DNA降解的發(fā)生早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化所以建立DNA分子水平的檢測(cè)對(duì)早期疾病的診斷有很重要的作用常見(jiàn)的檢測(cè)方法有凝膠電泳和原位切口末端標(biāo)記法
2.2.1凝膠電泳的檢測(cè)①原理凋亡發(fā)生時(shí)Ca2＋和Mg2＋濃度升高可激活細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶導(dǎo)致細(xì)胞核DNA雙鏈的斷裂形成大小為180bp～200bp倍數(shù)的寡核苷酸片斷進(jìn)行凝膠電泳分析可發(fā)現(xiàn)典型的梯狀帶②結(jié)果判定提取凋亡細(xì)胞的DNA片段并且使其純化加樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)溴化乙錠染色紫外燈下觀察可見(jiàn)凋亡細(xì)胞的DNA電泳后呈現(xiàn)獨(dú)特的梯形圖譜而壞死的細(xì)胞提取純化DNA在進(jìn)行電泳會(huì)出現(xiàn)模糊的連續(xù)膜狀條帶
2.2.2原位切口末端標(biāo)記法的檢測(cè)①原理在凋亡發(fā)生早期胞漿中Ca2＋和Mg2＋濃度升高可激活核酸內(nèi)切酶在該酶的作用下使染色質(zhì)核小體間的DNA產(chǎn)生缺口甚至發(fā)生斷裂此時(shí)末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶taggeddeoxynucleotideTdT能催化DNA鏈的3′OH端加到脫氧核糖核苷酸deoxyribotidedNTP上發(fā)生聚合反應(yīng)再將地高辛的配基偶聯(lián)于dNTP在TdT酶的催化下dNTP與地高辛配基偶合的核苷酸基團(tuán)可加合到DNA缺口或斷端處的3′OH上同時(shí)釋放出焦磷酸再使用熒光素標(biāo)記的地高辛抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與地高辛配基結(jié)合再通過(guò)3′3二氨基聯(lián)苯胺diaminobenzidineDAB作為底物進(jìn)行顯色即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到其染色質(zhì)DNA存在缺口或斷裂的細(xì)胞[10]②結(jié)果判定活細(xì)胞的細(xì)胞核在蘇木精復(fù)染后呈藍(lán)色核相對(duì)較大形狀大小較為一致凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)碎點(diǎn)核的形狀不規(guī)則大小不一該方法操作簡(jiǎn)單省時(shí)敏感性可靠一些科研工作者常用該方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡嚴(yán)玉霖等[11]在研究?jī)?nèi)毒素對(duì)肝細(xì)胞損傷的過(guò)程中利用該方法檢測(cè)到肝細(xì)胞發(fā)生了凋亡
2.3流式細(xì)胞儀FCM檢測(cè)
用FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡既可定性又可定量且具有操作簡(jiǎn)單快速和敏感等許多優(yōu)點(diǎn)但是檢驗(yàn)樣品前必須要通過(guò)調(diào)試流式細(xì)胞儀的閾值排除細(xì)胞碎片獲得單細(xì)胞懸液才能更好的檢測(cè)所以該方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵是樣品制備①原理細(xì)胞在通過(guò)流式細(xì)胞儀激光焦點(diǎn)時(shí)可以發(fā)生光的散射可以通過(guò)對(duì)不同角度反射光的分析可以得到細(xì)胞大小形狀和結(jié)構(gòu)的變化[12]凋亡的細(xì)胞經(jīng)碘二乙氧磷酰硫膽堿phospholineiodidePI煙酸己可堿hoechst等親DNA染料可染出相應(yīng)顏色并且結(jié)合的染料與DNA含量成正比即細(xì)胞激發(fā)后發(fā)射熒光強(qiáng)度與結(jié)合的染料的量成正比因此可以定量檢測(cè)②結(jié)果判定活細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的而不被著色而壞死和凋亡細(xì)胞由于失去完整性容易被著色正常細(xì)胞呈弱藍(lán)弱紅光凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)弱紅光壞死細(xì)胞呈弱藍(lán)強(qiáng)紅光[13]
2.4細(xì)胞凋亡酶學(xué)檢測(cè)
細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞膜破裂前胞漿中出現(xiàn)大量的單或寡核苷酸核小體而核小體由組蛋白及其伴隨的片段組成利用核小體進(jìn)行的酶學(xué)檢測(cè)而建立了夾心酶聯(lián)免疫吸附法enzymelinkedimmunosorbentassayELISA該方法更具有特異性高敏感性較少的細(xì)胞就可獲得結(jié)果現(xiàn)在有些科研工作者根據(jù)發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase3酶系統(tǒng)的活化[14]其水解作用可以活化胞漿內(nèi)多種成分和核內(nèi)的一些成分利用此過(guò)程建立了診斷方法①原理其原理與常規(guī)ELISA一致利用單克隆抗體特異性定量測(cè)定凋亡過(guò)程中裂解的單核小體或寡核苷酸小體②結(jié)果判定利用公式[15]EF=凋亡樣本的mU值發(fā)生凋亡的細(xì)胞/相應(yīng)正常樣品的mU對(duì)照值mU=吸收值103=雙孔吸收值的平均OD值－底物OD值若樣品的吸收值超過(guò)比色測(cè)定范圍應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)
3問(wèn)題與展望
選擇哪種方法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)不僅決定所研究凋亡的類(lèi)型所處的時(shí)期以及凋亡發(fā)生的原因也要考慮到要達(dá)到的目標(biāo)預(yù)期想獲得什么樣的結(jié)果等等去考慮用何種方法進(jìn)行檢驗(yàn)所以對(duì)凋亡檢測(cè)方法的選擇應(yīng)根據(jù)自己的情況而定一般說(shuō)來(lái)早期細(xì)胞凋亡的確定可采用夾心酶聯(lián)免疫吸附法ELISA法檢測(cè)晚期細(xì)胞凋亡可用原位末端標(biāo)記法凝膠電泳的檢測(cè)等如果需要定量檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡則采用流式細(xì)胞儀比較準(zhǔn)確可靠雖然對(duì)細(xì)胞凋亡檢測(cè)的方法越來(lái)越多但是單獨(dú)使用一種方法檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性所以需要選擇多種方法綜合各種方法的優(yōu)點(diǎn)即發(fā)展多參數(shù)檢測(cè)方法[16]一起檢測(cè)細(xì)胞凋亡才能獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)理認(rèn)識(shí)層次的深入了解相信將來(lái)肯定會(huì)出現(xiàn)一些敏感性高特異性強(qiáng)操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法
