讓你的柱子永遠(yuǎn)不壞沒那么夸張但是可以使柱子不那么快就壞

有時(shí)候你會(huì)發(fā)現(xiàn)好像你用了大部分的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)在不停的買液相色譜柱為什么色譜廠家不能把柱子的壽命延長一些呢實(shí)際上在合理的維護(hù)下柱子可以成為液相分析花費(fèi)里面很小的一部分舉一個(gè)例子一根典型的反相柱子的花銷在500-600美元, 如果它能進(jìn)樣500-1000次那么每一次進(jìn)樣的花費(fèi)是0.50-1美元. 盡管費(fèi)用會(huì)隨著實(shí)驗(yàn)室和特定方法不同而變化完成一次常規(guī)的進(jìn)樣分析50美元的總費(fèi)用是合理的這也可由做委托檢測業(yè)務(wù)的第三方實(shí)驗(yàn)室對(duì)類似分析的定價(jià)所確認(rèn)因此我們上面談到色譜柱的花費(fèi)在總分析成本中只占1-2%我們想方設(shè)法使柱子的壽命延長一倍即使單根柱子的成本還是很高實(shí)際上這樣做并不能在整個(gè)分析成本上降低很多我自己個(gè)人的感覺是如果你用一根柱子進(jìn)了500針那這樣就已經(jīng)很劃算了

在這個(gè)月的LC Troubleshooting的討論中我會(huì)考查柱子壽命的合理期望值應(yīng)該是多少然后再看一下可以延長柱子可用壽命的三種方法其中某些方法幾乎是沒有成本的

什么是合理的期望值

首先先看一下其他幾個(gè)色譜學(xué)家的經(jīng)驗(yàn) Ron Majors在他的色譜柱觀察（Column Watch）專欄的某期連載文章中已經(jīng)包含了針對(duì)色譜各個(gè)方面的用戶調(diào)查結(jié)果他有關(guān)色譜柱壽命的大部分專欄文章是在2012年發(fā)表的將作為我們目前討論的基礎(chǔ)圖1是基于 Ron Majors 2011年用戶調(diào)查數(shù)據(jù)的餅型圖可以看到有回應(yīng)的調(diào)查對(duì)象中接近四分之三的進(jìn)樣壽命在500針以上而且有近二分之一達(dá)到了至少 1000次的進(jìn)樣壽命這個(gè)結(jié)果對(duì)我來說是非常吃驚的因?yàn)樗藢?duì)所有類型的色譜柱的壽命調(diào)查不僅僅是現(xiàn)代液相中的最吃苦耐勞的用得最多的主力色譜柱4.6×150mm5μm反相柱相對(duì)于其它種類色譜柱它甚至有點(diǎn)刀槍不入的味道

圖1分析柱的典型進(jìn)樣次數(shù)數(shù)據(jù)基于2011 年調(diào)查

為了看清隨著時(shí)間變化情況改變的情形我做了一個(gè)1997年到2011年四個(gè)調(diào)查結(jié)果的比較圖見圖2可以看到有幾個(gè)明顯的趨勢第一我注意到綠柱綠柱代表的是在柱子損壞之前進(jìn)樣小于1000次的百分比從1997年的 76%跌倒了2011年的53%同時(shí)有明顯對(duì)比的是代表能進(jìn)樣1000以上的紫柱高度增加很快在上面我有提到我把進(jìn)樣500次作為柱子使用壽命的一個(gè)平衡點(diǎn)我們可以發(fā)現(xiàn)在柱子壞之前進(jìn)樣次數(shù)達(dá)不到500次的用戶的數(shù)量明顯下降從1997年的接近一半到2011的四分之一最后我們可看到有著可怕經(jīng)歷的用戶的數(shù)量即那些只能做到100或者更少的進(jìn)樣次數(shù)的用戶比例-基本上沒有改變徘徊在10%附近

圖2在LC柱子損壞之前進(jìn)樣次數(shù)的比較根據(jù)參考文獻(xiàn)1的數(shù)據(jù)

找出這種改變的原因只能是出于推測但是我很樂意做此推斷我不認(rèn)為柱子壽命有明顯的提升是因?yàn)橹庸に嚨母倪M(jìn)不可否認(rèn)在某個(gè)時(shí)期柱子塌陷或者是柱床中有空腔形成的情況非常普遍但是在1997年開展調(diào)查的時(shí)間段裝柱工藝就已經(jīng)非常成熟了由于裝柱工藝導(dǎo)致柱子損壞的情況很少見我認(rèn)為柱子壽命延長的主要原因是用戶受到更好的教育從而對(duì)樣品前處理和柱子的物理保護(hù)更好了柱子的保護(hù)方法就是我想在下文著重說明的我同時(shí)也推斷進(jìn)樣次數(shù)很穩(wěn)定的小于100與其說是柱子本身的原因還不如說是實(shí)驗(yàn)室操作存在問題或者說是某些應(yīng)用方法本身就是柱子終結(jié)者

不要未處理樣品就進(jìn)樣

在我的LC課堂中我經(jīng)常開玩笑的說延長柱子壽命的最好方法是不要打開色譜柱的盒子一旦你開始進(jìn)樣就開始了柱子走向滅亡的道路樣品有兩個(gè)主要方面可以影響色譜柱化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)我們把樣品中不要的化學(xué)污染物和微型顆粒清除的越好柱子的壽命就越長使用SPESolide- Phase extraction液液萃取和其他技術(shù)來除去化學(xué)污染物是LCGC中Sample Prep Perspectives專欄常有這樣的文章我就不在這里多說了一言以蔽之越多的樣品前處理越少的化學(xué)污染物進(jìn)入色譜柱柱子壽命就越長你還得平衡一下樣品前處理費(fèi)用和它帶來的好處比如你買了柱芯和試劑并加上你投入時(shí)間的費(fèi)用你在每個(gè)樣品上SPE的花費(fèi)會(huì)很容易超過5美元這是可以承受500次進(jìn)樣量的反相柱在每個(gè)樣品分析上分?jǐn)偝杀镜?倍多這差不多需要將色譜柱進(jìn)樣次數(shù)從500次延長至2500次才扯平了另一方面如果沒有做過任何處理的血漿樣品直接進(jìn)樣了柱子可能就只能進(jìn)樣10次左右你也要考慮到當(dāng)更多的樣品處理步驟加入的時(shí)候的數(shù)據(jù)質(zhì)量我知道在我們的實(shí)驗(yàn)室中這些措施可以讓我們?cè)诘蜐舛鹊臅r(shí)候收集到有用的數(shù)據(jù)并得到一致的結(jié)果而不是比較少的前處理步驟可能得到的結(jié)果

不論你做沒做其他前處理步驟幾乎所有的樣品都會(huì)從樣品過濾離心或者兩者中得到好處樣品經(jīng)過一個(gè)一次性的過濾膜過濾來移除可能堵住柱子進(jìn)口篩板的細(xì)顆粒物濾膜的孔徑不能大于柱子進(jìn)口篩板的孔徑大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板填料粒徑<3-μm的柱子比如UHPLC一般用0.2μm的進(jìn)口篩板最常用的樣品過濾膜是0.45μm孔徑的這個(gè)對(duì)除了亞2μm之外的其它柱子都已經(jīng)足夠亞2μm柱子則需用0.2μm的濾膜濾膜可作為預(yù)裝在一次性注射器中的柱芯也作為96孔板的過濾板即使這些過濾裝置一般是有效的但我不是非常強(qiáng)烈的推薦使用至少有4點(diǎn)使我不同意過濾樣品第一樣品過濾成本比較昂貴上一次我比較過價(jià)格一次性購買1000份每份的價(jià)格都要高于0.5美元-這個(gè)與柱子在每次分析中的分?jǐn)傎M(fèi)用幾乎一樣第二用0.5um濾膜過濾很慢而0.2μm濾膜則更慢第三如果你在一個(gè)監(jiān)管嚴(yán)格的環(huán)境中工作每一個(gè)樣品的處理步驟都必須一樣這就是說如果你過濾了一個(gè)樣品那么其他剩余的樣品也都要過濾無論實(shí)際上需不需要最后如果你要驗(yàn)證你的LC方法就需要驗(yàn)證所有的過濾步驟在過濾的過程中樣品會(huì)有損失如果50μL樣品經(jīng)過濾膜得到的樣品就少于50μL你得證明樣品不是選擇性的損失特別是在高或者低濃度的時(shí)候因此我們可以看到樣品過濾是需要花很多功夫和金錢的但是你要是不怕麻煩和不要求成本樣品過濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的

樣品過濾的一個(gè)替代方法（或者是補(bǔ)充）是在進(jìn)樣之前離心這是一個(gè)簡單又相對(duì)便宜的方法只要把樣品放進(jìn)離心管Eppendorf 離心管或者一個(gè)96孔的離心板再放到小型臺(tái)式離心機(jī)里調(diào)整轉(zhuǎn)速到其最大速度旋轉(zhuǎn)5-10min這會(huì)使會(huì)引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部然后把樣品轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶或板中繼續(xù)進(jìn)行分析這種技術(shù)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中對(duì)需要沉淀蛋白質(zhì)樣品中已經(jīng)使用了很多年而且極少出現(xiàn)顆粒物質(zhì)相關(guān)的問題我曾經(jīng)見過這樣的例子用 0.2um的濾膜過濾之后的樣品UHPLC進(jìn)樣這種樣品還是有一點(diǎn)渾濁并且引起了柱子堵塞但是這個(gè)些微渾濁的樣品離心至澄清之后柱子堵塞的情況就會(huì)減少很多

使用在線過濾器

我非常認(rèn)同一個(gè)在線的過濾器是LC或者UHPLC中使用成本最低的附加裝置可以提供最大的投資回報(bào)這種過濾器是一個(gè)非常簡單的改裝管配件其中包含了一個(gè)特定孔徑的篩板安裝在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子（保護(hù)柱如果用到的話）之間現(xiàn)在最普遍的裝置是一個(gè)直徑接近37.5px長度62.5px不銹鋼配件其中包含一個(gè)0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件這種PEEK過濾器整體是一次性的但是因?yàn)樗炔讳P鋼過濾器中的一次性使用的篩板要貴使用成本會(huì)比較昂貴這種在線過濾器孔徑會(huì)選擇比柱子篩板孔徑小一點(diǎn)因此它會(huì)在柱子堵塞之前先被堵塞當(dāng)系統(tǒng)壓力開始增加的時(shí)候你就知道在線過濾器中篩板已經(jīng)開始堵了需要在完全堵住之前替換掉

在線過濾器可以起到單獨(dú)的樣品過濾器一樣的功能但在樣品前處理時(shí)不需要額外的人力工作如果你樣品離心了偶爾有一些顆粒沒有過濾掉也會(huì)被下游的在線過濾器攔截住在線過濾器的另一優(yōu)點(diǎn)是它能夠很便捷的更換如果你動(dòng)手能力強(qiáng)在5min內(nèi)你可以關(guān)掉泵替換篩板打開系統(tǒng)并繼續(xù)實(shí)驗(yàn)你可能想要重新進(jìn)一針系統(tǒng)適應(yīng)性樣品來檢查一下系統(tǒng)有沒有出問題使用在線過濾器不需要大量的調(diào)節(jié)和校準(zhǔn)而這些更換保護(hù)柱時(shí)都需要重新做過在線過濾器的最后一個(gè)好處是可以過濾掉泵密封件和進(jìn)樣閥因磨損產(chǎn)生的顆粒物我強(qiáng)烈建議在每一個(gè)LC系統(tǒng)中都安裝一個(gè)在線過濾器即使你已經(jīng)在使用保護(hù)柱了

保護(hù)柱

保護(hù)柱（也叫做預(yù)柱）是一種很短的裝在分析柱上游的色譜柱這種柱子一般是10-20mm長包含與分析柱一樣的填料使用不大于分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板保護(hù)柱有雙重功能第一入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物第二填料與分析柱相同它可以捕抓住那些可能會(huì)強(qiáng)烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質(zhì)總所周知保護(hù)柱會(huì)延長分析柱的壽命然而保護(hù)柱有幾個(gè)潛在的問題第一他們比較貴---價(jià)格是分析柱的40%甚至更多考慮到增加的成本你獲得足夠的柱子壽命延長了嗎第二,保護(hù)柱到底能持續(xù)多長時(shí)間你得知道更換柱子的時(shí)間在保護(hù)柱上的化學(xué)污染物積累得太多之前,以免污染物進(jìn)入到分析柱中因此需要對(duì)進(jìn)樣次數(shù)計(jì)數(shù)或者做一個(gè)系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)來決定什么時(shí)候更換保護(hù)柱第三你要判斷怎么來清洗保護(hù)柱為了防止把污染物沖洗到分析柱中保護(hù)柱和分析柱需要分開來清洗嗎最后你可能會(huì)期待加入一個(gè) 20mm長的保護(hù)柱到150mm長的分析柱上能使柱效提高10%但是這種情況出現(xiàn)的非常少原因是接入一根保護(hù)柱會(huì)增加兩個(gè)柱頭連接件和一段管路到系統(tǒng)管路中而且保護(hù)柱沒有分析柱裝柱裝得好以上兩個(gè)方面都會(huì)拖低系統(tǒng)性能結(jié)果就是如果你運(yùn)氣好的話你會(huì)得到一樣的理論塔板數(shù)但常見的情況是柱效會(huì)稍有降低

要不要用保護(hù)柱的選擇權(quán)在你保護(hù)柱確實(shí)能延長分析柱的壽命但是我個(gè)人認(rèn)為在大多數(shù)情況下這并不值得如果你選擇使用保護(hù)柱我還是推薦在自動(dòng)進(jìn)樣器和保護(hù)柱之間連接使用一個(gè)在線過濾器過濾器的花費(fèi)只有保護(hù)柱花費(fèi)的零頭它還能延長保護(hù)柱的使用壽命就像它能延長分析柱壽命一樣

總結(jié)

盡管你不能讓你的分析柱的壽命無限延長但還是能用一些非常簡單的方法來延長色譜柱這個(gè)系統(tǒng)中比較昂貴部件的壽命首先按照要求對(duì)樣品進(jìn)行前處理樣品前處理的最后一步必須是過濾或者離心其次使用在線過濾器來保護(hù)保護(hù)柱和分析柱免于被樣品中或者系統(tǒng)其它部分產(chǎn)生的顆粒物堵塞再次如果保護(hù)柱對(duì)你的應(yīng)用有意義則使用保護(hù)柱來保護(hù)分析柱最后在每批樣品分析之后使用強(qiáng)溶劑來沖洗柱子除去在柱子上的任何強(qiáng)保留物質(zhì)

John W. Dolan作為LCGCLC Troubleshooting編輯已經(jīng) 30年作為專業(yè)領(lǐng)域最受尊敬的教授之一John現(xiàn)在是LC Resources（Walnut Creek, California）的副總裁和首席講師他還是LCGC顧問委員會(huì)的一員

此文章主要是針對(duì)柱子污染問題 但色譜柱壽命也取決于檢測品種的方法耐用性如果是難度很大的項(xiàng)目 譬如化學(xué)藥品種有多個(gè)有關(guān)物質(zhì)測定或中藥的指紋譜圖往往方法耐用性 （robustness）較差 柱子壽命也會(huì)受到影響挑選不同選擇性的色譜柱來改善分離度是提高方法耐用性的最佳選擇