單胞藻培養相關事項
對蝦種苗企業的生存主要是依靠蝦苗養殖效果來決定的蝦苗成活率的高低直接影響著產業鏈的上上下下單胞藻對于蝦苗早期是最適合的餌料如果培育得當不僅可以節約成本減少育苗水體環境負荷尤其是對于蝦苗的發育打下堅實的基礎提高成活率結合個人的育苗感受投喂單胞藻與不投喂的區別還是有的比如苗的變態時間縮短活力個頭大小水質均優于未投喂單胞藻的苗當然如果培育不得當反作用也有比如投喂有害菌超標的藻液藻類老化投喂過量等所以合理運用方可收到理想效果限于個人水平描述方法的錯誤不足之處懇請大家指正
一 單胞藻純培養室操作描述
儀器使用
（1） 超凈工作臺
使用前提前開機打開紫外線燈和風機開關20分鐘超凈臺面上不存放不必要的物品保持工作區內的凈化氣流不受干擾工作時盡量避免作明顯干擾氣流的動作超凈臺保持光滑水平光滑便于用酒精消毒布擦水平是倒培養基時使培養皿內平板厚度一致工作時超凈臺周圍空氣流動要緩慢雜菌盡量減少所以要定期清潔消毒保種室內關閉門窗盡可能減少雜菌數量空氣過濾網定期清潔
（2）真空泵和溶劑過濾器及過濾膜
此環節過濾只是為單胞藻純培養室（保種提純擴培試管級）準備清潔無菌海水其他級別的培養無需此環節
過濾膜使用0.2微米孔徑不可用手拿用鑷子選取真空泵與溶劑過濾器之間通過合適口徑的橡膠管連接緊密每次過濾要注意濾膜的過濾效果防止濾孔阻塞影響過濾效果濾瓶內的濾液不能沒過濾板出水口否則濾液將被抽吸入真空泵導致真空泵損壞
應該使濾板內的營養液過濾盡后（無水滴）才能停泵要定期注意真空泵內油量注意加油
（3） 恒溫鼓風干燥箱
設定溫度時先按控溫儀功能鍵SET進入溫度設定狀態此時SP設定顯示一閃一閃要按移動位鍵配合加鍵或減鍵設定時先從分位數字設定一直到百位數設定結束需按一下功能鍵SET,此時干燥箱進入升溫狀態加熱指示燈亮當箱內溫度接近設定溫度時加熱指示燈閃動多次控制進入恒溫狀態使用注意事項物品不能堆得太滿更不能堵住出風口以免影響溫度均勻上升若是有牛皮紙和保鮮膜時溫度不能超過180度取出物品時箱內外溫差不宜過高防止玻璃器皿炸裂橡膠制品不能放入
（4）加濕器
配合生化培養箱使用
水源是蒸餾水不應容器內帶水移動加濕器加水時應在容器上表示的滿水線為止
應注意的事項平時留意觀察水箱的存水量及時予以補充遠離熱源腐蝕物
（5） 蒸汽消毒器
容器加水時水位一定要超過電熱管最好是到3個支撐點的下緣如果連續使用應在每次消毒前補足蒸發水量不然少水會燒壞電熱管蓋上的放氣軟管插入消毒桶圓槽內對正蓋和主體的螺栓槽依次將相對方的翼型螺母予以旋緊使蓋與主體密合加熱開始時應將放氣閥與安全閥的小手柄扳至垂直放氣方位必須待有較急蒸汽噴出即將小手柄扳回水平關閉方位當到達所需壓力和溫度計算消毒時間消毒畢后關閉電源待壓力指針指向0時將放氣閥的小手柄扳至垂直放氣方位氣放完后打開容器蓋物品消毒后要迅速干燥應注意滅菌液體時不超過盛液體容器體積的3/4瓶塞不可用軟木塞或未打孔的橡膠塞滅菌器內冷空氣必須完全排除因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓當水蒸氣含冷空氣時壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分冷空氣壓力之和不是水蒸氣的實際壓力而同一壓力下的實際溫度含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽這樣導致達不了消毒效果絕不可堵塞安全閥出氣孔必須留空位保證其暢通放氣發現超溫超壓立即斷電
蒸餾器
先關閉放水閥打開進水閥待溢水皮管有水流出方可接通電源此時可暫時關閉進水閥待出水皮管有蒸餾水流出打開進水閥制備蒸餾水定期清洗蒸餾器內壁除去水垢不然影響蒸餾水質量和使用效果切不可關閉水閥制備蒸餾水否則燒壞電熱管
（6）鼓風機
定期更換吸氣口的過濾棉異常情況請電工檢查
（7）空調
保種室若有生長藻種需維持恒定溫度反之關閉一級二級空調視外界氣溫調整開關
二 衛生消毒
工具衛生消毒
1 濾水筒式過濾器筒式過濾器的濾芯應用一次更換一次用過的濾芯浸泡在1%鹽酸溶液中消毒12h以上然后用洗潔精清洗再用足量清水沖洗干凈晾干備用（濾芯規格應小于等于0.5微米）
2 試管（規格10毫升到20毫升）錐形瓶（50毫升到200毫升）500ml錐形瓶2.5L瓶廣口瓶移液管移液槍管/盒玻璃氣管膠氣管氣石溶劑過濾器培養皿用過后應當用清水清洗后浸泡于1% 鹽酸12h以上（溶劑過濾器除外浸泡時相近大小器皿分類放不同的消毒桶規格相差大易導致相互碰撞碎爛）然后用洗潔精清洗（用毛刷清洗試管底部時不可太用力否則底部易破裂）再用大量清水沖洗干凈風干或曬干高壓滅菌后放入恒溫干燥箱（膠氣管氣石除外）干燥備用
3聚乙烯藻袋 用于二級藻類藻種掛袋培養或3級擴培（一般使用盛裝藻液12升左右）先用清水沖洗干凈內外浸泡于1% 鹽酸12h以上再用大量清水沖洗干凈風干或曬干備用由于藻袋近似密封性對于防止微生物污染有很好的效果
4毛巾 保種室 一級和二級毛巾不可混用所用毛巾后都應消毒清洗晾干后備用
5錫箔紙 除非粘上油污或污物以及破損都應重復使用
6牛皮紙 定期拿到烘箱烘干
7定期更換空氣過濾器（用于12級培養的進氣過濾）的濾芯濾芯已油化或沖散的棄去
8定期更換鼓風機進風口的過濾棉
9對新購入的器皿應先除去包裝沾染的污垢后用洗潔精刷洗流水沖凈再浸泡于1%的鹽酸12h使游離的堿性物質除去再用清水沖洗干凈風干或曬干備用
室內衛生消毒
1保種室每天早上用清水擦洗實驗臺面地板墻壁木架后開紫外燈消毒20分鐘此時關掉空調關掉日光燈由于紫外燈照射會產生一定量的臭氧對人體有害所以消毒關閉紫外燈后人應隔一段時間再進去進保種室換鞋
2一級和二級室每天清潔接種前接種后承載物框架都應用消毒液消毒
3門口消毒池定期更換消毒藥水（高錳酸鉀）
4常用消毒劑濃度 1%鹽酸次氯酸鈉20ppm（有效氯）碘液（1000ppm）酒精70-75%,高錳酸鉀1mg/L.
三 接種
藻種固體培養基制備
所需燒杯玻棒須清洗干凈錐形瓶和培養皿須消毒清洗滅菌烘干將稱好的純化瓊脂粉加入燒杯再加入一定量的海水加熱（必須不停攪拌以免瓊脂糊底燒焦）至完全融化加熱后的瓊脂培養基應當透明無顯著沉淀若明顯可采用清潔的白色薄絨布或中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布鋪在漏斗上趁熱過濾融化畢后精確加入營養鹽（維生素B溶液須等培養基高壓滅菌后冷卻至50攝氏度以下再加）培養基采用121攝氏度高壓蒸汽滅菌20至30分鐘即可培養基滅菌后應立即取出冷卻至50攝氏度以下即加維生素B溶液將盛裝培養基的錐形瓶和培養皿放在超凈工作臺上點燃酒精燈右手托起錐形瓶底將瓶口在酒精燈稍加燒然后迅速將培養基倒入培養皿中以鋪滿皿底為止（厚薄適中）鋪放好后放置20-30分鐘待培養基凝固后即開始操作若是做斜面培養基則加入維生素B溶液后將盛裝培養基的錐形瓶和試管以及一根厚約1厘米的小木板放在超凈工作臺上分裝約為試管高度的1/3-2/3（視情況操作）分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面量為好擺置成適當斜面待其自然凝固培養基制備好后如發現破裂水分浸入色澤異常等均應棄去
待凝固后即進行操作現一般采用平板劃線接種和涂布接種
平板劃線接種
接種環在酒精燈火焰上充分燒紅后接種柄一邊轉動一邊慢慢來回通過火焰3次待冷卻至室溫方可挑取藻種（為保證藻種不被燙死挑種前可將接種環接觸培養皿內壁或培養基）迅速接種至新培養基（劃線可采用斜線法方格法曲線法放射法等）左手握住平板用大拇指和食指稍稍抬起皿蓋同時靠近火焰周圍右手持接種環伸入皿內在平板上一個區域作劃線（依方法不同動作不同）劃線時使接種環與平板表面成30-40度角輕輕接觸以腕力在表面作較快的滑動（注意不要劃破平板表面或伸進培養基內）接種環挑種后和劃線完抽出時均不可碰及皿壁/口更不能碰其它物體和臺面接種完后將接種環從柄部至環端逐漸通過酒精燈火焰滅菌不能直接燒環以免殘留在接種環上的藻體或菌體爆濺污染空間上述操作完成后即用無菌封口膜封培養皿口（膜使用前須用酒精消毒紫外燈消毒風干）封口時用左手大拇指摁住膜一邊末端右手大拇指和食指捏住另一邊末端迅速繞培養皿口繞一圈封口
涂布接種
所用種液必須經過弧菌檢測合格后方可使用涂布棒在火焰上慢慢來回過火焰3次冷卻（不可驟冷）將種液用移液槍從試管吸出注入平板上面（槍管不可碰及試管外壁更不能碰及其它物品或臺面）迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布讓藻液分布均勻畢后封口同平板劃線
補充試管液體培養基接種
所用種液必須經過弧菌檢測合格后方可使用火焰滅菌前試管口外壁不能有水滴（易導致受熱不均而破裂）燒試管口時試管傾斜45度角不斷移動試管使試管口受熱均勻滅菌時間3秒左右滅菌后不能驟冷防止試管破裂畢后用盛裝營養液150或200ml的錐形瓶（也要滅菌瓶口）向試管中傾倒營養液每次只能拿一個試管（注若幾個試管對比時可以同時拿在手里用大拇指和手掌）倒好后同樣試管和錐形瓶口滅菌試管塞也要滅菌塞試管塞時不要移動試管迎接塞以免試管在移動中納入可能含菌空氣火焰旁為無菌
所有試管分裝好后即接種用移液槍選取移液量（試管口滅菌）注入新培養基槍管不可碰及管外壁更不能碰及其它物品或臺面一支槍管只能和同一種液使用選取另一試管種液時必須更換槍頭接種畢后選取合適光照溫度培養由于試管培養是靜置培養而在靜置條件下藻細胞會聚集在試管底部且藻細胞周圍會形成透過養分的屏障營養鹽的攝入受阻光照吸收不均為使營養鹽攝入正常藻細胞受光均勻需要定時搖置試管（手先噴消毒酒精手腕使勁搖不要擺臂不能倒置搖）
三角瓶500ml瓶2.5L瓶液體培養基接種
三角瓶接種需無菌操作500ml瓶2.5L瓶液體培養基接種均在室內衛生條件下操作3種瓶和所需營養液及錫紙移液管洗耳球氣管氣石均需經消毒清洗滅菌后使用三角瓶需定時搖置500ml2.5L瓶培養在通氣條件下培養
二級聚乙烯藻袋液體培養基接種
氣管氣石均需經消毒清洗滅菌后使用抽藻管前次用畢后應當用水泵將管內灌滿消毒鹽酸溶液今次用前需用海水或淡水沖洗干凈后使用選取的種液應當是無明顯沉淀泡沫原生動物附著物色澤正常藻細胞密度大形態正常弧菌檢測合格后選用所用海水漂白水消毒有效氯應足10ppm曝氣12小時檢測余氯加硫代硫酸鈉中和方可使用若使用稀釋的漂白水應當天配制當天使用而未使用的要在24小時后棄去且稀釋的漂白水必須加蓋放在避光的容器內保存由于漂白水會隨時間漸漸分解一次性購入的漂白水不應太多不要過量儲存以免影響滅菌功效
1,23級接藻示意
試管 → 三角瓶 → 500ml瓶子 → 2500ml瓶子→ 20升的藻種聚乙烯袋 → 18升的擴培藻聚乙烯袋或者培藻池
