4.2 果膠酶活力測(cè)定

4.2.1 原理

果膠酶水解果膠,生成半乳糖醛酸半乳糖醛酸具有還原性糖醛基,可用次亞碘酸法定量測(cè)定,以此來表示果膠酶的活性

4.2.2 試劑和溶液

a.果膠粉Sigma公司出品 10g／L水溶液
稱取果膠粉1.0000g,精確至0.0002g,加水溶解,煮沸,冷卻如有不溶物則需進(jìn)行過濾pH至3.5,用水定容至100ml,在冰箱中貯存?zhèn)溆?span id="hbhz3ur" class="myIcon">使用時(shí)間不超過三天

b.硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液cNa2S2O3＝0.05mol／L 按GB 601配制與標(biāo)定 0.1mol／L溶液使用時(shí)準(zhǔn)確稀釋一倍

c.碳酸鈉溶液c1／2Na2CO3＝1mol／L 按GB 601配制

d.碘標(biāo)準(zhǔn)溶液c1／2I2＝0.1mol／L 按GB 601配制與標(biāo)定,貯存于棕色瓶中

e.硫酸溶液c1／2H2SO4＝2mol／L 取濃硫酸d＝1.845.6ml,緩慢加入適量水中,冷卻后用水定容至100ml,搖勻

f.可溶性淀粉指示液10g／L 按GB 603配制

g.0.1mol／L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液pH＝3.5
甲液 稱取檸檬酸C6H8O7H2O21.01g,用水溶解并定容至1000mL
乙液 稱取檸檬酸三鈉C6H5Na3O72H2O29.41g,用水溶解并定容至1000ml
取甲液140ml乙液60ml,混勻,緩沖液的pH應(yīng)為3.5用pH計(jì)調(diào)試

4.2.3 儀器

a.比色管 25ml

b.恒溫水浴 50±0.2℃

c.容量瓶 25ml50ml100ml200ml250ml

d.碘量瓶 250ml

e.吸管 1ml5ml

f.滴定管 25ml

4.2.4 試驗(yàn)程序

4.2.4.1 制備酶液

a.固體酶 用已知重量的50ml小燒杯,稱取樣品1.0000g,精確至0.0002g,以少量檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液pH＝3.5溶解,并用玻璃棒搗研,將上清液小心傾入適當(dāng)?shù)娜萘科恐?沉渣再加少量緩沖液,反復(fù)搗研3～4次,最后全部移入容量瓶,用緩沖液定容,搖勻,以四層紗布過濾,濾液供測(cè)試用

b.液體酶 準(zhǔn)確吸取濃縮酶液1.00ml于一定體積的容量瓶中,用檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液pH＝3.5稀釋定容

c.固體酶或濃縮酶液均須按附錄A要求,準(zhǔn)確稀釋至一定倍數(shù),酶液濃度應(yīng)控制在消耗0.05mol／L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液A－B之差在0.5～1.0ml范圍內(nèi)必要時(shí)可先做預(yù)備試驗(yàn)

4.2.4.2 測(cè)定

a.于甲乙兩支比色管中,分別加入10g／L果膠溶液5ml,在50±0.2℃水浴中預(yù)熱5～10min

b.向甲管空白中加檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液pH＝3.55ml乙管樣品中
加稀釋酶液1ml檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液pH＝3.54ml,立刻搖勻,計(jì)時(shí)在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)0.5h,立即取出,加熱煮沸5min終止反應(yīng),冷卻

c.取上述甲乙管反應(yīng)液各5ml放入碘量瓶中,準(zhǔn)確加入1mol／L碳酸鈉溶液1ml0.1mol／L碘液5ml,搖勻,于暗處放置20min

d.取出,加入2mol／L硫酸溶液2ml,用0.05mol／L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淺黃色,加淀粉指示液3滴,繼續(xù)滴定至藍(lán)色剛好消失為其終點(diǎn),記錄甲管空白 乙管樣品反應(yīng)液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積同時(shí)作平行樣品測(cè)定

4.2.5 試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算

1g酶粉或1ml酶液在50℃pH3.5的條件下,1h分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位
10X＝A－B×c×0.51×194.14×n×＝A－B×c×n×396.05 .......15×1×0.5式中X樣品的酶活力,u／gu／ml

A空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,ml

B樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,ml

c硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol／L

0.511毫摩爾硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51毫摩爾的游離半乳糖醛酸

194.14半乳糖醛酸的毫摩爾質(zhì)量,mg

n酶液稀釋倍數(shù)

10反應(yīng)液總體積,ml

5滴定時(shí)取反應(yīng)混合物的體積,ml

1反應(yīng)時(shí)加入稀釋酶液的體積,ml

0.5反應(yīng)時(shí)間,h

所得結(jié)果應(yīng)表示至整數(shù)

注果膠暫定用Sigma公司產(chǎn)品為標(biāo)準(zhǔn)底物若購(gòu)不到,使用其他廠產(chǎn)品時(shí), 必須作對(duì)照試驗(yàn)

4.2.6 結(jié)果的允許差

平行試驗(yàn),滴定時(shí)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積毫升不得超過0.05ml